asemanaabi

اساس تكنيك الكتروفورز ژل آگارز

بر اساس قوانين فيزيك وقتي جريان الكتريكي به محيطي شامل گونه هاي باردار مثبت و منفي اعمال مي شود، ساخت و نصب سكوبندي ازمايشگاهي انتظار مي رود گونه ها به سمت بار مخالف خود حركت كنند. اين قانون ساده كه همه ما با آن آشنايي داريم، اساس تكنينك الكتروفورز ژل آگارز است. اين روش در علوم زيستي به طور گسترده استفاده مي شود.

در ادامه اين مقاله با تعريف الكتروفورز آگارز، چگونگي عملكرد و كاربرد هاي آشنا خواهيد شد.

الكتروفورز ژل آگارز چيست؟

دستگاه الكتروفورز افقي كه براي بستر ژل آگارز مناسب است، براي جداسازي قطعات نوكلوئيك اسيد، DNA و RNA، استفاده مي شود. روي طسح آگارز منافذي وجود دارد. پس از لود نمونه حاوي DNA يا RNA روي ژل آگارز و اتصال جريان الكتريكي به آن، اين مولكول ها كه داراي بار منفي هستند، به سممت قطب مثبت مهاجرت مي كنند.

مولكول هاي آگارز با كنار هم قرار گرفتن، منافذ سه بعدي را ايجاد مي كنند. بنابراين نوكلوئيك اسيد هايي كه تحت جريان الكتريكي قرار گرفته اند، بر اساس اندازه تفكيك خواهند شد. در واقع مولكول هاي كوچك تر سريع تر حركت مي كنند و مولكول هاي بزرگ تر در منافذ گير مي افتند. به اين ترتيب نوار هايي از نوكلوئيك اسيد ها طبق اندازه آن ها روي ژل ايجاد مي شود. اين نوار ها را با استفاده از تابش فرانبفش (UV) مي توان مشاهده و تحليل كرد.

هنگامي الكتروفورز در حال انجام مي باشد به مرور دماي محيط پايه و بافرها  افزايش مي يابد كه منجر به تبخير حلال مي گردد، اين اثر سبب صعود بافر از هر دو بخش بافري به درون محيط پايه مي گردد، اين جريان دو طرفه بر حركت يون ها تأثير مي گذارد.

چگونگي عملكرد الكتروفورز ژل آگارز

آگارز يك پلي ساكاريد است كه معمولا از برخي جلبك هاي دريايي قرمز استخراج مي شود. مولكول هاي آگارز به صورت بسيار درهم پيچيده با پيونده هاي هيدروژني كنار يكديگر قرار گرفته اند. از بين كانال ها و منافذ ايجاد شده، مولكول هاي ديگري مي توانند عبور كنند.

آگارز به صورتي پودري سفيد رنگ است كه در تركيب با آب، پيوند هاي هيدروژني بين مولكول ها تشكيل مي شود. هنگامي كه ژل آگارز گرم شود، پيوند ها شكسته و به مايع تبديل مي شود. دوباره مي توان آن را داخل قالب ريخت.

درصد آگارز موجود در يك ژل بر اندازه منافذ و در نتيجه اندازه مولكول‌هايي كه ممكن است از آن عبور كنند و سرعت عبور آنها تأثير مي‌گذارد. هرچه درصد آگارز بيشتر باشد، اندازه منافذ كوچك‌تر است، بنابراين مولكول‌ها كوچك‌تر مي‌توانند عبور كنند و مهاجرت كند تر مي‌شود. در آزمايشگاه هاي زيستي، ژل آگارز 0.7-1٪ معمولاً براي جداسازي DNA روزانه استفاده مي شود، كه تمايز خوب و واضح قطعات را در محدوده 0.2-10 كيلوبايت ارائه مي دهد.

مولكول هايي كه با الكتروفورز ژل آگارز تفكيك مي شوند، مانند DNA، با چشم غير مسلح قابل مشاهده نيستند. بنابراين هنگام ست كردن آن ها روي ژل از تركيبات رنگي مانند اتيديوم برومايد (EtBr) استفاده مي شوند. مولكول هاي اين رنگ به DNA متصل مي شوند. با قرار گرفتن در معرض تابش UV خاصيت فلورسانس پيدا مي كنند. هر چه DNA بيشتر باشد، نوار روشن‌ تر مي‌شود.

نمونه هاي مخلوط شده با رنگ روي يك انتهاي ژل آگارز ست و در بافر غوطه ور مي شوند. سپس يك جريان الكتريكي توسط الكترودهاي هر انتهاي مخزن ژل، از ژل عبور مي كند. پس از اين كه به اندازه كافي مهاجرت انجام شد، با استفاده از نور UV و اندازه گيري هاي لازم، مي توان نتايج الكتروفورز را تحليل كرد.

مراحل تهيه ژل آگارز

1. قالب ژل را آماده كنيد.
2. شانه اي با دنده هاي مناسب روي قالب قرار دهيد.
3. حجم ژل مورد نظر را تعيين كنيد (اندازه گيري طول و عرض قالب و قطر ژل مورد نظر)
4. پودر آگارز را وزن كنيد.
5. آگارز را در بافر حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر ۱۰ ميلي ليتر ژل يك ميكروليتر از محلول اتيديوم برومايد اضافه كنيد سپس آن را مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد.
6. بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد.

الكتروفورز ژل آگارز چه كاربردي دارد؟

• الكتروفورز ژل آگارز را مي توان براي جداسازي مولكول ها بر مبناي بار يا وزن مولكوليشان استفاده نمود. مولكول هايي كه بار الكتريكي بيشتري دارند، تحرك يا مهاجرت بيشتري از خود نشان مي دهند و سريع تر منتقل مي شوند.
• آگارز براي جداسازي اسيد نوكلئيك ها و پروتئين هاي خيلي بزرگ استفاده مي شود.
• براي جداسازي بر اساس بار، ژل آگارز مناسب است.
• معمولا براي تفكيك قطعات بزرگ  (DNA  بزرگتر از 500 جفت باز) درصورتي كه هدف صرفا بررسي كيفي و تفكيك باشد، استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است .
• يكي از مهمترين كاربردهاي الكتروفورز ژل آگارز جداسازي بخش هاي حاصل از برش DNA با آنزيم هاي محدود كننده است.
• ژل آگارز مي تواند پروتئين ها را بر اساس اندازه و بار تفكيك كند. (DNA و RNA داراي بار منفي هستند در حالي كه بار پروتئين ها با توجه به آمينواسيد هاي ساختار مشخص مي شود.)

الكتروفورز ژل آگارز چه تفاوتي با پلي آكريل آميد دارد؟

• براي استفاده ژل آگارز بايد از الكتروفورز عمودي استفاده شود. در حالي كه الكتروفورز افقي مناسب آكريل آميد است.

• ژل آگارز به خاطر اندازه بزرگ منافذ، قدرت جداسازي و تفكيك پايين تري نسبت به اكريل آميد براي DNA دارد، اما دامنه جداسازي آن بسيار وسيع تر است.
• ژل آگارز نسب به آكريل آميد منافذ بزرگ تري دارد. بنابراين پلي آكريل آميد كه منافذ كوچك تري دارد، وضوح بهتري از تفكيك پروتئين ها كوچك مي دهد.
• تهيه ژل آگارز به مراتب سريع تر، آسان تر و كم هزينه تر از ژل پلي آكريل آميد مي باشد.